О хомяках и водорослях: внедрение хлоропластов в клетки животных

Для создания реплики чего-либо необходимо понять суть оригинала. Этот принцип является одним из фундаментальных, хоть и весьма тривиально звучащих, в клеточной инженерии. Однако, заложенное природой и невероятно долгой эволюцией нельзя просто скопировать в лабораторных условиях, если не найти путь обойти природные ограничения. К примеру, клетки, выращиваемые в лабораторных условиях, часто сталкиваются с проблемой роста ввиду нехватки кислорода, которую нельзя решить банальной закачкой большего объема кислорода в камеру, ибо это так не работает. Ученые из Токийского университета (Япония) нашли выход из данной ситуации, внедрив энергопроизводящие хлоропласты из водорослей в клетки хомяков, тем самым улучшив клеточный рост. Ранее подобная комбинация клеток растений и клеток животных считалась невозможной. Как именно ученым это удалось, и какие преимущества получили животные клетки от растительных? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых.

Основа исследования

Фотосинтез является одним из самых древних процессов, возникший порядка 3.5 миллиардов лет тому назад. Этот процесс имел колоссальное влияние на глобальные условия окружающей среды и эволюцию всех видов. Бактерии, подобные цианобактериям, которые появились 1.8 миллиарда лет назад, были захвачены и сохранены в клетках-хозяевах 1.2–1.6 миллиарда лет назад, что привело к эволюции хлоропластов в водорослях. В области синтетической биологии исследователи пытались искусственно создать фотосинтез, который развивался на протяжении долгой истории Земли, с помощью подходов «снизу вверх» и «сверху вниз». В настоящее время проводится исследование по синтезу искусственных хлоропластов хемосинтетическим путем на молекулярном уровне в качестве подхода «снизу вверх», который включает в себя создание органелл из природных и синтетических молекул. Также было проведено много исследований по модификации нативных хлоропластов для обеспечения возможности их использования в гетерологичных средах в качестве подхода «сверху вниз», направленного на улучшение функции нативных органелл.

Восемьдесят лет назад было обнаружено, что хлоропласты, изолированные от растений, могут сохранять свою фотосинтетическую активность. К сожалению, то, как изолированные хлоропласты могут сохранять активность в течение определенного периода времени, остается загадкой, учитывая потерю большинства генов, необходимых для фотосинтеза, синтеза белка и роста из генома хлоропластов в ходе эволюции водорослей и растений. Хотя механизмы, лежащие в основе поглощения и выживания хлоропластов или водорослей в клетках-хозяевах, остаются неясными, имеются сообщения о передаче фотосинтетической активности неродственным клеточным системам. Примерами служат клептопластия у слизней Sacoglossa и поглощение водорослей саламандрой Ambystoma maculatum. Поэтому многие исследователи пытались имитировать эти явления in vitro, вводя изолированные хлоропласты в клетки других видов. Однако эти включенные хлоропласты могут сохранять свою правильную морфологию в клетках-хозяевах всего несколько часов, а их фотосинтетическая активность остается неподтвержденной. На сегодняшний день не было сообщений о переносе изолированных хлоропластов в гетерологичную клетку-хозяина, что привело бы к обнаружимому фотосинтезу в клетке-хозяине.

Исследования фотосинтетической терапии проводились для лечения заболеваний путем индукции фотосинтеза в тканях и органах животных с использованием инъекций водорослей или тилакоидных мембран. В недавнем исследовании наноразмерные тилакоиды, введенные в хондроциты, связанные с дегенеративными заболеваниями (например, остеоартритом), в которых истощены NADPH (от Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, т.е. никотинамидадениндинуклеотидфосфат) и ATP (от Adenosine triphosphate, т.е. аденозинтрифосфат), вырабатывали энергию, тем самым способствуя активации анаболизма животных клеток. Поэтому и было предложено, что введение хлоропластов непосредственно в животные клетки без каких-либо модификаций может быть экономически эффективным методом увеличения выработки энергии.

Чтобы прояснить механизм, лежащий в основе эволюции водорослей и самоподдерживающихся хлоропластов для улучшения будущих приложений, связанных с фотосинтетической терапией, ученые ввели нативные хлоропласты в культивируемые клетки животных, которые впоследствии были проанализированы с точки зрения их фотосинтетической активности. В этом исследовании хлоропласты красной водоросли Cyanidioschyzon merolae (сокращенно, schyzon или шизон) были введены в культивируемые клетки млекопитающих. Шизон, сохранивший примитивные характеристики предковых водорослей, существует в сильнокислых и вулканических горячих источниках, которые, по-видимому, отражают доисторические условия окружающей среды Земли. Фактически, шизон обычно культивируется при температуре 42-45 °C в среде с pH 1.5-2.3. Геномы хлоропластов водорослей обычно содержат всего около 100 генов, но геном шизона включает 243 гена. Это говорит о том, что хлоропласт шизона может оставаться жизнеспособным в клетках животных в течение длительного времени. Примечательно, что многие клетки водорослей становятся неактивными при температуре ниже 37 °C, что является оптимальной температурой для культивируемых клеток млекопитающих, но клетки шизона остаются активными при этой температуре, что делает их полезными для исследований в области синтетической биологии.

В отличие от хлоропластов цветковых растений, хлоропласты водорослей редко дифференцируются в другие пластиды, такие как лейкопласты или этиопласты, в ответ на изменения окружающей среды. Ученые предположили, что хлоропласты, включенные в клетки животных, могут оставаться стабильными и непрерывно вырабатывать энергию независимо от условий окружающей среды. Более того, ученые успешно разработали метод выделения хлоропластов из шизона и продемонстрировали с помощью рентгеновского анализа, что внутренняя структура изолированных хлоропластов остается неповрежденной.

В качестве клеток млекопитающих, культивируемых в качестве хозяина, была использована клеточная линия яичника китайского хомячка (CHO)-K1, которая использовалась для биопродукции ценных веществ и антител. Клетки CHO-K1 очень восприимчивы к экзогенным веществам, что делает их пригодными для поддержания хлоропластов водорослей. Также были проведены измерения фотосинтетической активности хлоропластов водорослей в клетках CHO-K1 с помощью флуорометрии с амплитудно-импульсной модуляцией изображения (PAM от pulse-amplitude modulation).

Результаты исследования

Изображение №1

Для выделения хлоропластов из шизона клетки водорослей обрабатывали гипотоническим раствором, а затем суспендировали и гомогенизировали в растворе кукурузного крахмала перед центрифугированием в градиенте гомогенности (1A). Изолированные хлоропласты представляли собой сферические структуры диаметром приблизительно 2 мкм (1B). Фотохимическая эффективность фотосистемы II (PSII от photosystem II) в изолированных хлоропластах впоследствии была количественно определена с использованием двухмодуляционного флуориметра FL 3500 для определения максимального квантового выхода PSII (Fv/Fm). Для надлежащей оценки функции PSII целые клетки и хлоропласты были обработаны 3-(3, 4-хлорфенил)-1,1-диметилмочевиной (DCMU), которая может ингибировать перенос электронов из PSII.

Изображение №2

Как для целых клеток, так и для изолированных хлоропластов выход флуоресценции хлорофилла снижался независимо от того, обрабатывались ли они DCMU (2A). Уменьшение выхода флуоресценции хлорофилла было меньше для изолированных хлоропластов, чем для целых клеток. Это указывает на то, что цепь переноса электронов была менее эффективна в изолированных хлоропластах, чем в целых клетках. Однако после обработки DCMU уменьшение выхода флуоресценции хлорофилла было одинаковым между изолированными хлоропластами и целыми клетками и было намного меньше, чем уменьшение в отсутствие DCMU, что отражает значительное снижение эффективности цепи переноса электронов. Поэтому ученые пришли к выводу, что цепь переноса электронов была функциональной даже в изолированных хлоропластах. Более того, значение Fv/Fm, определенное по соответствующим кривым затухания флуоресценции, существенно не отличалось между изолированными хлоропластами (в среднем 0.32) и целыми клетками (в среднем 0.39) (2B).

Кроме того, не наблюдалось никаких морфологических аномалий или снижения флуоресценции хлоропластов после длительного хранения при 4 °C (2C). На основе визуализации флуориметрии PAM была проанализирована активность PSII каждого изолированного хлоропласта во время длительного хранения. Стабильные значения Fv/Fm были получены даже после 6 дней хранения (2D). Эти результаты показывают, что хлоропласты, изолированные из шизона, могут поддерживать функциональную PSII в течение длительного периода хранения при низких температурах, что делает их полезными для последующих экспериментов.

Изображение №3

Чтобы исследовать, являются ли изолированные хлоропласты фотосинтетически активными в клеточной среде млекопитающих, ученые сначала совместно культивировали клетки CHO-K1 с изолированными хлоропластами (соотношение 1:100) в течение 2 дней, чтобы клетки CHO-K1 могли включить изолированные хлоропласты (3A). В течение 2 дней совместного культивирования клетки CHO-K1 имели более высокую скорость роста, чем контрольные клетки CHO-K1 (т. е. культивируемые без хлоропластов; 3B). После совместного культивирования с хлоропластами был проведен анализ изображений с помощью конфокальной микроскопии. Примерно 20% клеток CHO-K1 содержали 1–3 хлоропласта на 0 день после совместного культивирования (3B, 3C). Когда совместно культивируемые клетки инкубировались в течение 2 и 4 дней после совместного культивирования без пассирования, количество включенных хлоропластов на клетку уменьшалось (3D), вероятно, из-за субклеточного переваривания хлоропластов в клетках CHO-K1 или случайного распределения по дочерним клеткам после деления клеток CHO-K1.

Интересно, что на 0-й день после совместного культивирования было обнаружено, что 1% клеток CHO-K1 являются хлоропластричными клетками, которые захватили семь или более хлоропластов (7–45 хлоропластов на клетку) (3D). Включенные хлоропласты были локализованы циркулярно в цитоплазме клеток CHO-K1 (3E). Кроме того, были обнаружены митохондрии, окружающие включенные хлоропласты, а также субклеточное пространство между хлоропластами и митохондриями (3F).

Изображение №4

Для более точного анализа субклеточной локализации инкорпорированных хлоропластов ученые провели конфокальный микроскопический анализ сверхвысокого разрешения с использованием ДНК-окрашивания для визуализации ядра (4A). Некоторые хлоропласты были локализованы вблизи ядерной наружной мембраны и контактировали с ядерной наружной мембраной в трех измерениях (4A), но они не проникали в ядро (4B). ДНК хлоропластов была обнаружена в центре инкорпорированных хлоропластов. Это позволяет предположить, что ДНК хлоропластов сохранялась в клетках CHO-K1.

Чтобы более подробно изучить структуру мембраны, ученые проанализировали хлоропласты, включенные в клетки животных, с помощью электронной микроскопии. Поскольку клетки CHO-K1 с хлоропластами составляли всего 2–20 % всех клеток (3D), поиск клеток с включенными хлоропластами в поле зрения микроскопа был длительным и трудоемким процессом. Учитывая отсутствие внутриклеточных органелл с хлорофиллом в клетках животных, электронно-микроскопические изображения можно эффективно получать, если для обнаружения клеток с включенными хлоропластами использовать автофлуоресценцию хлорофилла. Поэтому был проведен корреляционный анализ световой и электронной микроскопии (CLEM от correlative light and electron microscopy), в котором флуоресценция и пигменты в образце обнаруживались с помощью светового микроскопа, после чего тот же образец и та же область исследовались с помощью электронного микроскопа. Полученные изображения CLEM накладывались и коррелировались для выявления ультраструктуры клетки или органеллы, где локализовалась целевая молекула.

Изображение №5

Сначала проводился поиск клеток CHO-K1 с включенными хлоропластами на основе автофлуоресценции хлорофилла, обнаруженной с помощью флуоресцентного микроскопа (5A). Координаты положения клеток CHO-K1 с хлоропластами были записаны, и клетки в том же положении были заключены в смолу и разрезаны, затем исследованы с помощью сканирующего электронного микроскопа (5B).

Изолированные хлоропласты заключены в двойную оболочку и имеют несколько слоев тилакоидных мембран, которые не образуют стопки гран в хлоропластах наземных растений (5C). На 0 день после совместного культивирования было выявлено два типа хлоропластов, окруженных мембраной в клетках CHO-K1: один сохранял слоистую структуру тилакоидных мембран, похожую на структуру в неповрежденном хлоропласте (5D), тогда как другой содержал частично деформированные тилакоидные мембраны (5E).

Через 2 дня после совместного культивирования было отмечено увеличение пространства между тилакоидными мембранами в некоторых хлоропластах, которые также имели увеличенные пластоглобулы (т. е. пластохинонсодержащие липопротеиновые частицы, присутствующие в хлоропластах в условиях биотического стресса) (5F, 5G). Через 4 дня после совместного культивирования слоистая структура тилакоидных мембран, по-видимому, была деградирована (5H). Хлоропласты были включены в субклеточную везикулу и были окружены митохондриями (5D, 5E, 5F), что соответствовало изображению флуоресцентной микроскопии (3F). Включенный хлоропласт был расположен вблизи ядра, но оболочка хлоропласта, по-видимому, не была связана с внешней ядерной мембраной и не входила в нуклеоплазму (5D).

Изображение №6

Ученые провели анализ PAM визуализации для измерения эффективного квантового выхода (ϕII) хлоропластов в клетках CHO-K1 на 0, 2 и 4 день после совместного культивирования (график выше). Ученые выбрали клетку CHO-K1 с инкорпорированными хлоропластами с помощью микроскопа и облучили ее непрерывным актиничным красным светом (625 нм) при 2.8 мкмоль/м²/с, после чего ϕII был рассчитан. Не было никаких существенных различий в ϕII между интактными хлоропластами и хлоропластами в клетках CHO-K1 на 0 и 2 день после совместного культивирования. Принимая во внимание эти результаты, а также наблюдаемое сохранение морфологии тилакоидной мембраны в инкорпорированных хлоропластах в течение первых 2 дней после совместного культивирования, весьма вероятно, что система транспорта электронов в хлоропластах функционировала в клетках млекопитающих по крайней мере до 2-го дня. Однако фотосинтетическая активность в инкорпорированных хлоропластах значительно снизилась через 4 дня после совместного культивирования, что свидетельствует о том, что хлоропласты в клетках CHO-K1 не функционировали нормально.

Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых.

Эпилог

В рассмотренном нами сегодня труде ученые попытались внедрить хлоропласты водорослей в клетки млекопитающих, дабы улучшить рост последних за счет фотосинтетических свойств хлоропласт.

В природе существуют примеры того, как водоросли существуют в симбиозе с животным-хозяином, примером чего являются гигантские моллюски. Водоросли содержат хлоропласты, и поэтому могут фотосинтезировать свет в пищу и кислород. В то время как моллюски обеспечивают дом для водорослей, водоросли обеспечивают энергию.

Животные, в отличие от растений и водорослей, лишены хлоропластов, но это не значит что их можно внедрить, как продемонстрировали ученые в данном труде. Ученые использовали хлоропласты красной водоросли Cyanidioschyzon merolae и внедрили их в культивируемые клетки хомяков. В ходе исследования была изучена структура хлоропластов внутри клеток, а также измерение электронного транспорта фотосинтетической активности. Результаты анализов показали, что хлоропласты смогли прожить порядка 2 дней внутри животных клеток, что ранее считалось невозможным.

Авторы исследования отмечают, что их результаты хоть и будут крайне полезны для клеточной инженерии. Выращиваемые клетки, ткани и органы в лабораториях подвержены гипоксии клеток, что предотвращает их деление и рост. Если же внедрять в них хлоропласты, то это обеспечит достаточный уровень кислорода, что в свою очередь обеспечит рост. Следовательно, спектр возможностей клеточной инженерии возрастет в разы.

Немного рекламы

Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 — 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB — от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?